《山东大学学报(理学版)》

弱化H+-ATPase的德氏乳杆菌乳酸亚种的生理特性研究

高莉莉,马霞,赵宏飞,裴家伟,吕兆林,张柏林*

2008, 43(7): 1-09 . doi:

摘要 ( 1622 )

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以德氏乳杆菌乳酸亚种（L5）为出发菌株，以新霉素为选择 "压力"，获得了弱化H+-ATPase变异菌株5M1、5M6和5B1。与出发菌株L5（对照）相比，各变异株的H+-ATPase活力分别下降51.3%、27.7%和34.3％。对变异株5M1、5M6和5B1的形态及其生理特性研究表明，变异株的细胞较菌株L5细长。L5的ATP含量为0.63×10-18mol/个，明显低于变异菌株；变异株5M6和5B1的ATP含量分别为1.18×10-18mol/个和1.38×10-18mol/个；变异株5M1的ATP含量最高，约为1.60×10-18mol/个。当各菌株在MRS培养基中37℃培养12h后，变异株表现出较高的谷氨酸到γ-氨基丁酸的转化率，其中变异株5M6最高，为16.73%，变异株5M1和5B1谷氨酸转化率居中，分别为15.6%和15.4%，出发菌株L5的谷氨酸转化率最低，为13.91%。与出发菌株L5相比，变异株5M6、5M1和5B1的H+-ATPase活性下降导致其耐酸性和耐盐性降低。

可控性自裂解乳球菌的构建

王绍花,孔健*,陈福坤

2008, 43(7): 10-13 . doi:

摘要 ( 1536 )

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为阐明发酵乳杆菌温和噬菌体φPYB5编码的由穿孔素(Hyb5)和裂解素(Lyb5)组成的裂解盒在乳酸菌中的作用特征，将hyb5-lyb5基因克隆到E. coli/L. lactis穿梭质粒pSEC的nisin诱导型启动子下游，构建了重组质粒pSEC-hyb5-lyb5。将pSEC-hyb5-lyb5电转入Lactococcus lactis NZ9000，获得重组菌株NZphl。经nisin诱导表达后，Hyb5-Lyb5表现出高的裂解活性，使NZphl菌液的浊度（OD600）急剧下降，并释放出大量胞内蛋白，为利用自裂解菌株生产优质乳制品奠定了基础。

Lp-1643蛋白单一结构域的黏附功能研究

刘芳,都立辉,杨丽杰,杜鹏,霍贵成*

2008, 43(7): 14-17 . doi:

摘要 ( 1290 )

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从植物乳杆菌KLDS 1.0320中克隆出Lp-1643蛋白N端的第一个结构域基因，与表达载体pET30a连接后成功构建重组质粒pET30a/N1。重组质粒转化大肠杆菌BL21后，以IPTG进行诱导，重组蛋白以可溶形式成功获得表达。通过亲和色谱技术用HisTrap FF柱对重组蛋白进行了分离纯化。以BSA作为对照，研究了重组蛋白His-N1对KLDS 1.0320菌株黏附Caco-2细胞的影响，发现用该重组蛋白预处理Caco-2细胞之后，其上黏附的KLDS 1.0320数量显著减少（P<0.05）。这说明Lp-1643蛋白N端的第一个结构域具有黏附Caco-2细胞的功能。

新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析

赵蕊,霍贵成*

2008, 43(7): 18-22 . doi:

摘要 ( 1545 )

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从15份采自新疆伊犁牧民家庭传统方法制作的酸奶子中分离出71株乳酸菌，并进行了生理生化表型特征鉴定。对其中的28株菌测定了16S rRNA基因全序列，构建系统发生树，结合生理生化结果，鉴定结果为，该酸奶子中乳酸菌涉及5个属、11个种及亚种，有些菌株对生长温度适应性较强。乳杆菌为新疆酸奶子中的优势菌属，以瑞士乳杆菌(Lb. helveticus)为最优势。

酵母粉质量浓度对德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS 1.9201分批发酵动力学的影响

李艾黎,霍贵成*,邓凯波

2008, 43(7): 23-27 . doi:

摘要 ( 1419 )

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比较了德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS 1.9201在不同生长阶段的生长速率和产酸速率，分析了在乳清培养基中添加不同质量浓度酵母粉（0～20g/L）对该菌株分批发酵动力学参数的影响。结果表明：不论添加酵母粉与否，KLDS 1.9201的增殖速率和产酸速率均成正比例递增关系。随着酵母粉质量浓度提高到10g/L，KLDS 1.9201生长偶联期的持续时间由6 h缩短至4h，最高生长速率达到1.28g/L·h，在3h减速期内产生的乳酸量几乎占总产量的39％。但酵母粉添加量超过20g/L时对菌体生长反而有一定抑制作用。

产α-半乳糖苷酶乳酸菌的鉴定及其发酵性能研究

陈俊亮,杨丽杰,霍贵成*

2008, 43(7): 28-32 . doi:

摘要 ( 1336 )

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从传统乳制品中筛选到2株高产α-半乳糖苷酶的菌株，经菌株形态和生理生化特性鉴定以及16S rRNA基因序列分析，确定为发酵乳酸杆菌和长双歧杆菌，并命名为LB21和KLDS2.0509。同时研究了2株菌在豆乳中的酶活力、产酸性能、棉子糖降解能力和蛋白水解能力。菌株LB21和KLDS2.0509表现出不同的α-半乳糖苷酶活力，其最高酶活力分别为26.8U/mL和31.5U/mL，发酵终点pH分别为5.1和5.0，两者均能有效地降解棉子糖，蛋白水解能力随着发酵时间的增加而增强。

1株产细菌素乳杆菌的鉴定及其所产抑菌物质的特性

贡汉生,孟祥晨*

2008, 43(7): 33-39 . doi:

摘要 ( 1307 )

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从分离自内蒙古传统乳制品的67株乳杆菌中筛选得到1株产细菌素的乳杆菌KLDS 1.0355。通过API 50生化反应实验和16S rDNA序列同源性分析，鉴定该菌株为短乳杆菌。应用琼脂扩散法研究了KLDS 1.0355无细胞发酵上清液的部分特性，KLDS 1.0355的无细胞发酵上清液对热（121℃，30min）和pH值（pH 2.0～10.0）稳定，可被多种蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶K失活，不能被过氧化氢酶失活，说明该抑菌物质为1种蛋白质。进一步证明了该抑菌物质的作用方式是杀菌，且抑菌谱广，可抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

离心条件对双歧杆菌存活力的影响

杜鹏,刘芳,霍贵成*

2008, 43(7): 40-44 . doi:

摘要 ( 1503 )

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优化离心力、离心时间和离心温度等离心参数，研究其对双歧杆菌存活力的影响。确定了在4℃，6000g离心时间30min的条件下，长双歧杆菌KLDS 2.0001和婴儿双歧杆菌KLDS 2.0002两菌株的存活率最高，分别达到了94.49%和91.19%。

酸奶子中乳杆菌生长性能的研究

赵蕊,苏安分,许婷玉,霍贵成*

2008, 43(7): 45-50 . doi:

摘要 ( 1374 )

PDF (319KB) ( 1340 )

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从新疆伊犁酸奶子中分离到38株乳杆菌，在不同温度下对其进行生长、产酸性能和蛋白水解能力检测。结果表明许多菌株的生长温度范围比对照菌株嗜酸乳杆菌要宽，不同温度下生长产酸性能和蛋白水解能力都与菌种相关，同时存在较大的菌株间差异。这些乳杆菌菌株生长特性多样，许多菌株性状优良，有广阔的开发应用前景。

酸适应乳酸菌的筛选及其酸适应条件的研究

刘怀龙,孟祥晨*

2008, 43(7): 51-55 . doi:

摘要 ( 1558 )

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对24株包括双歧杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和保加利亚乳杆菌在内的4类乳酸菌酸耐受力进行评价，结果发现除4株保加利亚乳杆菌有较强的酸耐受力外，其余20株均为酸敏感菌株。将这20株酸敏感菌株酸适应（pH 4.5，1h）后，有13株菌的酸耐受力得到提高。其中，乳酸乳球菌KLDS4.0312酸适应能力最强，酸适应后其酸耐受力可提高7542倍。确定了乳酸乳球菌KLDS4.0312最佳酸适应条件为pH 4.5，30min，且稳定期的菌体酸适应后，酸耐受力仅能提高27倍，酸适应能力明显低于对数期菌体。

利用PCR-DGGE技术分析微生态制剂在传代过程中的菌群变化

马俊孝,孔健* ,季明杰

2008, 43(7): 56-60 . doi:

摘要 ( 1277 )

PDF (579KB) ( 1435 )

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利用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）技术，结合传统平板培养法对实验室研制的1种由乳酸菌和芽孢杆菌组成的微生态菌剂WS-401及其在连续转接培养过程中细菌种群组成的动态变化进行分析。WS-401原液的活菌数为2×107 cfu/mL，且细胞个体形态多样。将分离自原液的3株细菌进行DGGE分析，出现2种指纹谱带，对照标准的DGGE指纹图谱库和序列分析，分别被鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。将该菌剂分别在LB和MRS两种培养基中30℃或37℃连续转接5次，DGGE分析每次转接后培养物的菌群组成，结果发现，随着转接次数的增加，微生物菌群的种类减少，在LB培养基中转接5次后优势菌群只有蜡状芽胞杆菌，而在MRS培养基中转接后优势菌群为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和类干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。由此说明，微生物的营养基质和培养条件对微生态制剂在传代过程中的菌群组成和动态变化有重要影响。

产广谱细菌素乳酸菌的筛选

胡淑敏,孔健,季明杰*

2008, 43(7): 61-64 . doi:

摘要 ( 1712 )

PDF (427KB) ( 1637 )

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利用牛津杯双层平板法从70株乳酸菌中筛选得到2株具有较高抑菌活性的乳酸菌LAB30、LAB211。研究这2株乳酸菌的抑菌物质发现：排除酸性产物乳酸、乙酸以及过氧化氢的干扰，LAB211和LAB30仍具有较高的抑菌活性；对其发酵液进行蛋白酶处理，LAB30的发酵液经胰蛋白酶和蛋白酶K处理后抑菌活性均有降低；而LAB211的发酵液经蛋白酶K处理后有所降低，胰蛋白酶处理没有变化，因此可以判定这两株乳酸菌产生的抑菌物质为细菌素。利用特异性引物PCR分析可知，LAB211和LAB30产生的细菌素并非nisin。抑菌谱实验表明，LAB30和LAB211的发酵液不仅抑制革兰氏阳性菌，而且对部分革兰氏阴性菌也有抑制作用。因此LAB211和LAB30产生的是一类广谱细菌素。

盐诱导乳清蛋白冷凝胶对双歧杆菌的保护作用

张久龙,孟祥晨*

2008, 43(7): 65-68 . doi:

摘要 ( 1532 )

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探讨盐诱导乳清分离蛋白（whey protein isolates, WPI）形成的包含双歧杆菌的乳清蛋白冷凝胶（cold-set gels of whey protein containing bifidobacteria，CGWPCB）对双歧杆菌的保护作用。借助扫描电子显微镜和物性仪观察凝胶结构，评价以氯化钙为凝胶剂，形成的CGWPCB对双歧杆菌的保护作用。结果表明，7.5mmol/L CaCl2诱导8% WPI形成的网络状冷凝在pH 1.5的酸环境下对双歧杆菌的保护性最好，作用120min后菌落数下降3个数量级，菌体存活率达到0.42%。说明制备的乳清蛋白冷凝胶对双歧杆菌有良好的保护性，为益生菌产品的开发和应用提供了参考。

Paenibacillus sp. K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

陆文伟,孔文涛,孙芝兰,孔健*,季明杰

2008, 43(7): 69-73 . doi:

摘要 ( 1574 )

PDF (503KB) ( 1295 )

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从鲜牛奶中分离到1株产β-galactosidase的细菌，经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillus sp. K1。提取该菌株的染色体DNA，以pUC18（lac-）为载体，构建其DNA文库；在含有X-gal的LB平板上筛选该文库，得到6个蓝色菌落；对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定，鉴定出1个编码全长为2028bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21（DE3）中，实现了β-半乳糖苷酶高效表达，其酶活为25.06U/mL，高于原始菌株的4.55U/mL，并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。

Paenibacillus sp. K1 乳糖酶基因bga在乳酸乳球菌中的表达

孙芝兰,孔文涛,孔健*

2008, 43(7): 74-77 . doi:

摘要 ( 1480 )

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为了提高乳酸乳球菌利用乳糖的能力，缓解乳糖不耐症，以实验室构建的含有乳糖酶基因的质粒pUC-bga为模板，通过PCR扩增得到乳糖酶基因bga，将其分别与载体pSEC和pMG36e连接，获得重组质粒pSEC-bga和pMG36e-bga，重组质粒分别电转Lactococcus lactis NZ9000和Lactococcus lactis MG1614，并在乳酸乳球菌细胞内实现了活性表达。高压液相色谱（HPLC）分析其对培养基中乳糖的利用能力，结果重组菌L.lactis NZ9000-Bga对乳糖的利用能力比对照菌株高一倍，为生产低乳糖的发酵乳制品奠定了基础。

乳酸乳球菌nisin抗性基因的克隆及作为筛选标记的研究

郭婷婷,孔文涛,孔健*,季明杰

2008, 43(7): 78-82 . doi:

摘要 ( 1409 )

PDF (485KB) ( 1390 )

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在添加500U/mL nisin和溴甲酚紫的GM17选择性培养基上，分离到5株nisin抗性菌株。根据形态观察，生理生化特性和16S rDNA基因序列比对被鉴定为乳酸乳球菌。根据已报道nisin抗性基因设计引物，分别以这5株菌的染色体和质粒DNA为模板进行PCR扩增，结果从1株抗性菌株的染色体上得到目的基因产物。通过序列测定和同源性比对，证明为nisin抗性基因（nsr）。将nsr基因克隆到乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pTRKH2上，重组质粒命名为pT-nsr。pT-nsr电转化乳酸乳球菌MG1614，获得的重组菌MG1614/pT-nsr在含有500U/mL nisin的培养基中生长情况良好。这表明nsr基因赋予宿主菌抗nisin特性，并且与红霉素抗性功能相同，因此nsr基因可以作为筛选标记用于食品级载体的构建。

发酵乳杆菌β-半乳糖苷酶转糖基活性研究

陆文伟,孔文涛,孔健,季明杰*

2008, 43(7): 83-87 . doi:

摘要 ( 1354 )

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从传统发酵乳制品中筛选到1株转糖基活性较高的乳杆菌，经16S rDNA菌种鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum， EU621851）K4。以乳糖为底物，研究β-半乳糖苷酶粗酶液在不同pH、乳糖浓度、反应温度和时间的转糖基活性。结果表明在pH 5.5、乳糖20%、温度50℃条件下反应48h，转糖基活性最高，能生成多种低聚半乳糖。研究发现在低乳糖含量（5%）和pH 5～7范围内都具有明显的转糖基活性。用牛奶为原料进行转糖基能力测定，结果该酶既能降低牛乳中的乳糖含量，又能生成低聚半乳糖。因此，菌株Lb. fermentum K4在乳制品发酵中具有潜在的应用价值。

产胞外多糖的嗜热链球菌ST冷冻干燥制剂的研究

吴荣荣,王立平,高莉莉,刘伯衢,张柏林*

2008, 43(7): 88-96 . doi:

摘要 ( 1282 )

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从当地市售的传统酸奶中分离出一株产胞外多糖的链球菌，经生理生化和16S rDNA序列分析，将该菌株确定为嗜热链球菌ST。在补充了20g·L-1的葡萄糖，初始pH7.0的培养基上，40℃，培养24h后，其胞外多糖产量为55.62mg·L-1。进一步的结构分析显示，此多糖的主要单糖组成为葡萄糖。在生产嗜热链球菌ST冷冻干燥制剂时，其最佳的增殖培养基组成为脱脂奶粉100.0g·L-1，酵母膏3.0g·L-1，碳酸钙9.0g·L-1和乳清粉20.0g·L-1，活菌数达到1.05×109CFU·mL-1。由脱脂奶粉160.0g·L-1、甘油30.0g·L-1谷氨酸钠30.0g·L-1和5.0g·L-1吐温80构成的保护剂能明显改善菌体细胞在冷冻干燥条件下的存活能力。在发酵温度37℃、搅拌转速90r·min-1和pH5.9的条件下培养，经冷冻干燥获得的直投式发酵剂产品的活菌数量可达1.7×1011CFU·g-1。当采用固形物仅为80.0g·L-1的还原乳做为原料时，与不产胞外多糖的菌株生产的酸乳相比，采用该产品制备成的产品乳清析较少。

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